代表性成果之一：若干重要生理活性天然产物的化学与生物学研究

• 关键字: 代表性成果之一：若干重要生理活性天然产物的化学与生物学研究 发布者：宣传部 发布时间：2009-02-23 11:02:42 点击数: 20293次

代表性研究成果一	基础类或 应用基础类或基础性类	成果为第一完成单位	本室固定 人员参加 名单	是否 保密
若干重要生理活性天然产物的化学与生物学研究	基础类	是	马大为、俞飚、伍贻康、姚祝军	否

具有重要生物学意义的复杂结构天然产物的全合成是有机化学的主要领域之一，是推动化学、药学等学科发展的重要动力和思想源泉。针对复杂性、多样性结构的天然产物的全合成研究不仅带动有机化学新反应和有机合成新方法的发现和发展，也促进着有机合成设计水平的整体提高。因此，复杂天然产物合成的能力往往被认为是一个国家或一个专业学术机构的有机化学整体水平的重要标志。同时，天然产物具有的各种生理活性又给我们的现代科学和社会发展带来很多的机会，特别是为各种新药的创制和生命科学规律的揭示提供了新的契机，基于生理活性天然产物的研究已经成为化学与生命科学交叉科学领域中具有特色的主题内容，并日益受到科学界的重视。

在以往传统优势的基础上，实验室在最近的五年中围绕生理活性天然产物的研究开展了大量的原始性工作，并获得了一批重要的结果。在2004-2008期间我们这个领域共发表近90篇文章。根据检索统计，2004年1月至2008年12月的五年里，中国（包括大陆、香港和台湾地区）在化学科学领域两个最为重要的国际刊物J. Am. Chem. Soc.和 Angew. Chem. Int. Ed.中一共发表了16篇有关天然产物全合成的工作，其中出自本室的工作有9篇，占50%以上。同时，通过这些工作我们也培养了一批具有处理交叉性和复杂性科学问题能力的青年人才。值得一提的是，其中的大部分工作作为主要内容，分别获得了国家自然科学二等奖（2007）、上海市科技进步一等奖 （2005）和上海市自然科学二等奖（2006）。其中，受到较大关注的论文包括：

Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4222	被国际网络杂志Organic Chemistry Highlights亮点介绍
Org. Lett. 2005, 7, 4237	被Natural Product Reports杂志在其Hot Press栏目中报道
J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 5872	被Synfacts 专文评价
Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 3614	被Synfacts 专文评价
J. Org. Chem. 2008, 73, 5221	作选为Featured Article发表
Chem. Eur. J. 2006, 12, 7615	被Faculty of 1000 Biology亮点介绍
ChemMedChem 2007, 2, 288	被选为ChemMedChem 的封面文章
ChemBioChem 2007, 8, 172	被选为ChemBioChem 的封面文章

以下是所取得的代表性重要进展：

一、具有重要生理活性的复杂天然产物的第一次全合成
具有重要生理活性的复杂天然产物的全合成，特别是首次全合成一直是有机合成界充满竞争性的主题。在过去五年里，我们在国际同行的激烈竞争中完成了10类具有显著抗炎、抗肿瘤、抗艾滋病、免疫调节等作用的复杂结构天然产物的第一次全合成，这些具有国际影响的工作包括：
1.1具有强抗炎活性天然环酯肽Halipeptins的首次全合成
Halipeptins是意大利化学家L. Gomez-Paloma等人从Vanuatu岛海水的海绵Haliclona sp.中分离得到的16元的大环酯肽，具有很强的抗炎活性。这一家族共有四个天然产物，命名为Halipeptins A，B，C和D。我们从六元内酯出发，经过不对称烯丙基化和Kiyooka-Mukayama Aldol缩合两步关键反应，并进行保护基操作得到HTMMD片断；从2-丁炔-1-醇出发，接上手性辅基和甘氨酸片断后，经过关键的aza-Claisen重排，再进行保护基操作得到NMeHIle片断；以氨基腈与α-甲基半胱氨酸衍生物反应得到Thiazoline片断；最后通过片段连接，关大环等步骤完成了Halipeptin A的第一次全合成 (Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 135)。值得一提的是，这个结果是在与包括国际顶尖合成化学家K. C. Nicolaou等其他三个研究小组的竞争中取得的。根据上面的研究我们又发展了一条利用天冬氨酸衍生物的不对称烷基化合成NMeHIle片断的新方法，进而完成了Halipeptins B，C和D的全合成 (Chem. Eur. J. 2006, 12, 6572)。
 

1.2强抗炎活性环酯肽Salinamide A的首次全合成
Salinamide A是从海洋Streptomyces中分离出的环酯肽。分子中具有两个大环和一个不稳定的烯基环氧片段。它具有很强的抗炎活性，并显示出很强的抑制细菌RNA聚合酶的作用 (IC50 = 0.5 M)。我们通过利用Sharpless不对称环氧化，酚羟基的开环反应等关键步骤合成的必要的片段，然后通过两次酰胺键形成的方式关两个大环，完成了这个天然产物的第一次全合成 (Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 3614)。该工作被Synfacts (2008, 0902)专文评价。
 

1.3强抑制爱滋病毒HIV-1RF的复杂环肽Papuamides的首次全合成
Papuamides是从新几内亚巴布亚岛的海绵中分离出的环酯肽。生物活性测试表明，Papuamides A和 B都可以以EC50 = 4 ng/mL 的强度抑制爱滋病毒HIV-1RF对于人正常淋巴细胞的感染。Papuamide A 也具有很强的细胞毒性，对于多个肿瘤细胞株的IC50 在 75 ng/mL 左右。由于其重要的生物活性和独特的化学结构，最近十年来有近10个国际研究小组对其进行了合成研究。其环酯肽部分的合成已经被报道，但是边链和整个分子的合成还没有报道，边链的立体化学也没有确定。对于它们的全合成研究不仅可以确定其结构，同时也为这类具有重要生物活性的天然产物的结构-活性关系研究奠定基础。我们通过一系列研究，以L-丝氨酸为原料合成了Papuamide B的环酯肽片断的3-OHLeu和β-OMeTyr两个非天然氨基酸片断。然后采用[3+2+2]的片断连接策略，把环酯肽片断的各个氨基酸片断连接起来，最后用HATU/DIPEA的条件关环得到了Papuamide B的环酯肽片断。用Wittig反应构建出了Dhdta片断的Z，E构型的二烯部分从而完成了Dhdta片断合成。然后合成了含有Dhdta片断的四醇的八个立体异构体。但通过核磁谱图的对比，我们仅能确定Dhdta的双羟基的相对构型为syn构型。接着我们从L-苏氨酸出发参照文献方法合成了支链四肽的Dab片断。氢化四取代内酯得到了两个甲基构型为syn的产物,接着氨解和氧化伯醇就可以构建出DiMeGln片断。通过分步把二肽和和环酯肽部分相连,然后脱保护就得到了四个含不同Dhdta异构体的最终产物，发现该天然产物原来的结构鉴定有误。最近通过对其二胺基氨基酸部位构型的改变，得到了和天然产物谱图一致的产物，这样我们不仅完成了Papuamide B的第一次全合成，也建立了Papuamide B中边链的三个手性中心的立体化学，并纠正了原来假设的一个手性中心的立体化学 (Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2844)。

1.4强效免疫抑制作用的环四肽FR235222的首次全合成
FR235222是一个从微生物中分离出的在动物模型上具有强效免疫抑制作用的环四肽。我们通过利用RCM反应等关键步骤合成了其Aoh片段，利用(R)-焦谷氨酸为手性源，发展了一条高效合成其4-甲基脯氨酸单元的方法。最后通过片段连接，关大环的方法完成了这个化合物的第一次全合成 (Org. Lett. 2005, 7, 2775)。

1.5 p53-MDM2相互作用抑制剂(4S,8R,9S)-Chlorofusin的首次全合成
Chlorofusin是英国剑桥大学化学家William教授于2001年在微生物代谢产物中分离得到的环肽化合物，它能够有效抑制p53-MDM2之间的相互作用( IC50 = 4.6 μM, KD = 4.7 μM)。它的结构由九个氨基酸残基连接而成的二十七元环肽型大环化合物，通过鸟氨酸末端的氨基与一个结构新颖的发色团相连接。
在我们小组和Scripps的Boger小组的努力下，发色团相对构型及绝对构型得到修正、归属及确证。我们从2001年就开始对chlorofusin进行全合成研究，开展了一系列基础性方法研究，最后利用汇聚式策略和自己发展的一锅法构建螺环法，实现了带游离氨基的环肽片段直接插入azaphilone前体，首次完成了(4S,8R,9S)-chlorofusin及其两个立体异构体的对映选择性全合成（J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 6400）。利用我们合成的中间体作为模型化合物，并结合NMR和X-单晶衍射，成功修正了chlorofusin发色团部分最初确定的相对构型，上述结论被随后发表的Boger的第二次全合成所确认，我们建立的基本方法成为后续发表的全合成的主要方法。通过chlorofusin的全合成工作，我们还发展了稳定的苯丙异吡喃盐的一系列化学转化，并成功用于另一类具有较强抗疟活性的天然产物cassiarins A和B的全合成，该文被2008年的J. Org. Chem. (2008, 73, 5221) 作为Featured Article发表。
 

1.6具有显著细胞毒性的生物碱Lepadins A和B的首次全合成
Lepadins A，B 是从一种深海被囊动物Clavelina lepadiformis中分离得到的具有顺式十氢喹啉的的生物碱，它们具有显著的细胞毒性。最近德国 A. D. Wright小组和澳大利亚 A. R. Carroll 小组从同属的背囊动物 didemnum 和 aplidium tabas- cum中几乎同时分离得到五个具有顺式十氢喹啉结构的生物碱，并分别命名为lepadin D, E, F, G, H，对它们进行的生物活性测试表明，他们的细胞毒性虽然较低，但在抗疟原虫，抗锥体虫方面有较好的活性，因此可能作为新型抗疟疾药物先导化合物。我们利用L-丙胺酸为原料，通过转化得到具有两个手性中心的溴代物，将其与1,3-环己二酮缩合并关环得到烯胺，然后通过高选择性的不对称非均相催化氢化构建了关键中间体顺式十氢喹啉酮。接着，借助构象分析分别在顺式十氢喹啉5位立体选择性地引入α和β-型两种取代基，从而发展了对于Lepadin B目前路线最短的全合成。同时lepadins D , E 和 H的首次全合成，并通过合成确定了其5’位孤立羟基的相对构型，以及这些化合物的绝对构型 (Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4222)。这个工作被国际网络杂志Organic Chemistry Highlights (http://www.organic-chemistry.org/Highlights/2005/23May.shtm) 亮点介绍。认为是“代表了高效、非对映选择性地合成环醚和环胺类天然产物的现代水平”的四个例子之一。
 
在上述工作的基础上，利用类似的中间体，我们也发展了一条高效的合成具有抗癌和抑制尼古丁受体活性的clavepictines A，B 和pictamine三个生物碱的全合成 (Org. Lett. 2006, 8, 3179)。
 

1.7抗肿瘤活性环状三萜皂甙Lobatoside E的首次全合成
1986年，两个由中日化学家组成的研究团队几乎同时报道了从中药土贝母中分离得到一个结构新颖的环状三萜皂甙。迄今，共有20个该类结构的化合物从土贝母和盒子草中被分离鉴定。这些化合物具有显著的抗肿瘤活性, 其中Lobatoside E具有最强的活性和选择性，它对肺癌细胞A549、结肠癌细胞SW620和黑素瘤细胞SK-MEL-5的半数抑制浓度GI50达0.14－0.36 M。化学合成这样一个由三萜、寡糖和二酸构成的环状天然产物具有极大的挑战性。我们从廉价的原料出发经总共73步，以线性最长31步和1.2%的总产率首次实现了Lobatoside E的全合成。该工作发表于J. Am. Chem. Soc. (2008, 130, 5872)。并被Synfacts (2008, 1010) 专文评价。
 

1.8抗肿瘤活性的新颖甾体皂甙Candicanoside A的首次全合成
Candicanoside A是从南非的百合科植物Galtonia candicans中发现的一个结构新颖的甾体皂甙，它的甾体边链发生了从未发现过的重排，并通过分子内的缩醛形成笼状结构。该化合物显示了较强的抗肿瘤活性，如对HL-60肿瘤细胞的半生长抑制浓度为32 nM，与临床抗肿瘤药物etoposide 和 methotrexate相当。而且，通过比较发现该化合物具有不同的抗肿瘤作用机制。我们通过总共37步，线性最长27步，总产率1%完成了对该分子的首次全合成。该工作发表于Angew. Chem. Int. Ed. (2007, 46, 2527)。

 
1.9新颖结构的抗炎活性断环皂甙Betavulgaroside III的首次全合成
某些三萜皂甙的末端糖基经氧化断裂形成了结构新颖的断环皂甙，这些天然产物难以分离和结构鉴定。另外，这些结构中含有多个羧基，与介导炎症的四糖SLex有一定的相似性，具有潜在的抗炎活性。我们实现了对其中典型的成员，从中药牛膝和甜菜中分离鉴定的Betavulgaroside III的首次全合成。该工作发表于J. Org. Chem. (2008, 73, 4978)。全合成以阿拉伯糖、葡萄糖和齐墩果酸为原料，共经31步，线性23步，总产率0.9%。在合成中，为了避免对甙元的氧化，采用了先合成了断环二糖给体，再连接上甙元的策略。
 

1.10具有肝素酶抑制活性的酚糖苷CRM646-A/B的首次全合成
CRM646-A/B是从Acremonium sp. MT70646中分离的结构新颖的酚糖苷化合物。其甙元属depsides类，在地衣中分布较多，但其糖苷化产物很少，而CRM646-A/B是唯一的depsides葡萄糖醛酸苷化合物。CRM646-A/B对肝素酶有较强的抑制活性（IC50 = 3 M 和10 M）；对B16-F10黑色素瘤迁移抑制的IC50为15 M 和30 M。我们完成了对CRM646-A/B的首次全合成 （J. Org. Chem. 2005, 70, 8884）。
 

 二、具有抗肿瘤活性的天然产物的合成，结构-活性关系及作用机制研究
生理活性天然产物是现代化学生物学研究最佳切入口之一。作为本研究室的特色方向，我们不仅十分重视那些生理活性重要且结构新颖的天然产物的全合成工作，而且也非常关注具有显著生理活性的天然产物以及天然产物结构修饰物在现代生物学、药学研究中的重要应用。作为正向化学生物学的重要课题，我们在全合成工作的基础上积极开展了一系列天然产物和天然产物类似物的作用机制研究，并取得了一系列重要的原创性结果。

2.1 Apratoxin A的抗肿瘤活性与作用机制研究
Apratoxin A是Moore教授等人从关岛的Apra港口收集的海洋蓝藻细菌Lyngbya majuscula产生的二级代谢产物中分离得到的具有强抗癌活性的大环内酯内酰胺 (IC50 = 0.53 nM for KB cells)。我们对它的合成和Apratoxin A结构-活性关系进行了研究。利用最近发展的丙酮和醛的直接不对称Aldol反应和手性试剂诱导的Aldol反应我们首先合成了Apratoxin A中的Dtena片段。然后通过DAST诱导的形成的噁唑啉环反应和L-Proline-N-Me-Ile酰胺键部位关环等关键步骤合成了Apratoxin A的噁唑啉类似物。然后经过大量的条件试探，发现利用Kelly发展的仿生法能够很方便地合成我们所需要的噻唑啉环。最后完成了天然产物Apratoxin A的合成。整个合成包含了28步线性步骤，总产率为1.1% (Chem. Eur. J. 2006, 12, 7615，该论文被Faculty of 1000 Biology亮点介绍http://www.f1000biology.com/article/id/ 1033270/evaluation )。根据上面的合成路线，我们也合成了几个结构简化的类似物，发现简单的噁唑啉环取代的Apratoxin A类似物具有和Apratoxin A同一个数量级的抗肿瘤活性，而两个在脂肪酸单元的碳链上进行结构简化而得到的类似物的活性较差。这些结果为Apratoxin A结构-活性关系提供了初步的信息。进一步研究发现这些化合物可以在50 nM浓度下有效地将肿瘤细胞—HeLa细胞的细胞周期抑制在G1期。说明这些抗肿瘤化合物可能是通过阻断细胞周期的方式而抑制肿瘤细胞的分化。在结构-活性关系研究的基础上，我们发展出带有标记，同时保持了高活性的工具分子Biotin-oz-apraA (0748)，和生物学家合作，发现了这类天然产物的可能靶点是休克蛋白HSP70蛋白复合物中的一个蛋白。该化合物与HSP70结合以后，可以抑制休克蛋白HSP90的活性。在此过程中我们发现通过Apratoxin A类似物的抑制作用，HSP90的顾客蛋白会通过自吞噬的机制进行降解，而不是通过已知的通过蛋白体酶的作用进行降解。这个结果揭示了自吞噬的一个新功能。文章已被J. Cell. Biol. (2009, accepted) 接收发表。
 

 
2.2 Palau’amide的结构改造与抗肿瘤活性研究
Palau’amide是Moore等人从海洋蓝藻细菌Lyngbya产生的二级代谢产物中分离得到的另外一个具有强抗癌活性的大环内酯内酰胺。我们利用手性试剂诱导的Aldol反应和接下来的底物诱导的Aldol反应，得到了关键的不饱和醛中间体。然后通过与适当的肽片段连接并进行关大环，完成了对于这个化合物假定结构的第一次全合成，但是发现合成得到的化合物与报道的数据不符合，因此说明假定的结构在确定时有一定的误解。进一步研究发现合成的化合物对于三种肿瘤细胞Hela, A549 和 BGC 生长的半抑制有效浓度分别为 39 nM, 19 nM, 和 26 nM。这与Palau’amide的抗肿瘤活性相当，说明我们合成的化合物与Palau’amide在与相应的生物大分子相互作用时的构象类似 (Org. Lett. 2005, 7, 4237)。这个工作被Natural Product Reports (2005, 22, 668) 杂志在其Hot Press栏目中报道。
 

2.3 OSW类皂甙的结构-活性关系及作用机制 
OSW类皂甙是日本化学家 Sashida等自 1992年以来从南非的一类百合科植物 （如Ornithogalum saundersiae 等）中分离出来的一类结构新颖的皂甙分子。1995年后，这类分子中的一些被发现具有超强的抗肿瘤活性。如分子 OSW-1 对肿瘤细胞 (NIH60个肿瘤细胞株)的抑制率是现临床使用的抗癌药物(如甲氨喋呤、阿霉素、顺铂、喜树碱和紫杉醇等)的10－100倍以上，而对正常细胞没有毒性。对负P388肿瘤的小鼠注射OSW-1 (0.01 mg/kg) 一次，能使其平均成活率比对照组小鼠延长59％。如此强烈的活性引起了国际上的广泛注意。很多研究小组开展了对此类分子的各方面研究。我们曾在国际竞争中率先完成了对OSW-1的全合成 (J. Org. Chem. 1999, 64, 202；该论文已被他引60余次)。我们后续的细胞生物学研究则表明：OSW1可以激活Caspase-8, 激活的Caspase-8能够切割Bcl-2, 从而诱导了肿瘤细胞的凋亡。在此基础上，我们对该类分子进行了系统的结构改造和活性筛选，获得了全面的构效关系。特别是发现了活性保留的新结构化合物，申请了发明专利保护，同时，我们还发展了对该类结构骨架的高效合成新方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4324；J. Org. Chem. 2005, 70, 10354），可以快速获取这类活性化合物，并根据已有的构效关系和合成路线，我们还设计并合成了一些活性保持的探针分子，如带有生物素的OSW-1衍生物；为运用这些探针来寻找OSW-1在细胞内的靶分子的研究工作的开展奠定了基础。
 

2.4常见植物甾体皂甙的结构-活性关系及作用机制
很多植物甾体皂甙在结构上包括糖和甾体两个部分，一般具有亲水亲脂的两亲性质，在生化实验室长期被用作破坏细胞膜的试剂。近年来发现一些甾体皂甙分子能够显著抑制肿瘤细胞增殖，并诱导肿瘤细胞发生凋亡。由于生源合成的原因，天然皂甙以复杂同系物的形式存在，通过分离获得足够的量及结构多样性来进行深入研究并不现实。因此，以往的研究多数使用混合物或有限的纯化合物，未能在分子水平上研究其分子靶标和作用机理。我们组近年来发展了一系列的对皂甙的化学合成方法，实现了通过化学手段来获取大量的皂甙分子，并可以较随意地进行结构改造和衍生化。我们系统地合成并测定了上百个结构相关的甾体皂甙的溶血（与对细胞膜结构的破坏有关）和抗肿瘤细胞生长活性。对甾体皂甙的抗肿瘤活性的构效关系有了较全面的了解；并且否定了皂甙的抗肿瘤活性与其对细胞膜结构的破坏有关的传统认识。在构效关系的基础上，我们还制备了显示不同抗肿瘤活性的荧光探针分子，并研究了它们的细胞行为。发现其抗肿瘤活性与其跨膜的能力相关，并选择性定位于溶酶体，然后导致细胞凋亡。该工作被选为ChemMedChem 的封面故事（ChemMedChem 2007, 2, 288）。

2.5番荔枝内酯类似物AA005的抗肿瘤作用机制研究
AA005是本室在天然产物番荔枝内酯bullatacin基础上发展出来的具有选择性抗肿瘤作用的天然产物类似物(Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 329)。最近五年，我们围绕AA005的抗癌机制研究与中科院上海生科院吴家睿教授进行了深入的合作研究，证明了AA005具有诱导癌细胞坏死的特性，作用于线粒体并抑制氧化还原电子链的传递；同时，我们借助荧光标记化合物以及荧光共聚焦成像技术成功获得了AA005选择性进入癌细胞并在线粒体周围富集的实验证据（ChemBioChem 2007, 8, 172）。该工作被欧洲化学生物学杂志ChemBioChem作为封面故事发表。
 
最近，我们结合生化证据揭示了GluT4的运输机制是导致AA005选择性作用于一系列癌细胞的主要原因。由机制研究的信息，我们在AA005构效关系研究中也获得了重要进展，通过系统切换分子碎片获得了若干比AA005具有更强活性的化合物，如AA067等（Chem. Eur. J. 2008, 14, 8632. 中国发明专利申请号2007 1 0043520.0 和2007 1 0043519.8）。AA005的发明、设计概念与相关机制研究工作是番荔枝内酯及其类似物研究领域一个比较成功的例子，有关内容多次被邀请报告，并在2006年由Wiley-VCH出版的天然产物系列丛书中获邀撰写一个章节介绍过去若干年的重要成果。

2.6青藤碱类似物1032的免疫抑制机制研究
青藤碱是从中药单体成分，有一定的抗炎作用而被用于治疗类风湿病。我们提出“改善植物来源天然产物成药性”的基本概念，将青藤碱和药物碎片（杂环）结构修饰整合后，其抗炎作用显著增强。通过筛选B细胞和T细胞的活性（细胞活性反映整体效果），我们获得了一系列活性化合物，其最好的化合物活性被提高550倍。然后选取个别活性较好的化合物针对与免疫缺陷有关系的动物EAU实验模型进行实际治疗效果的初步评价，获得了活性和毒性(1032对于C57小鼠半致死量为368 mg/kg，相应地，青藤碱为258 mg/kg) 均可以被接受且有实际疗效(C57小鼠有效剂量10-30 mg/kg)的化合物1032作为进一步机理研究的第一个化学探针。通过一系列的实验证明了1032对TNF-α信号通路有抑制作用。获得的青藤碱衍生物1032成为具有潜在自免疫疾病治疗作用的先导化合物，申请了知识产权保护（中国发明专利：200810032755.4；200510030835.2和200510024478.9）。